注意事項(xiàng)：
1．基礎(chǔ)程序；
2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；
3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；
5．PCR 反應(yīng)液的配制；
6．PCR技術(shù)的基本原理；
7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；
8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
鏈霉素〖硫酸鹽〗保存Anti-Phospho MDM2 (S185) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 細(xì)胞生物 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

氯化溶菌酶使用說明書Anti-Phospho MARK2 (T595) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 細(xì)胞生物 免疫學(xué) 神經(jīng)生物學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 生長因子和激素

氨肽酶抑制劑鹽酸鹽實(shí)驗(yàn)步驟Anti-Phospho MEF2D (Ser444) Antibody研究領(lǐng)域 細(xì)菌及

溴甲酚紫鈉實(shí)驗(yàn)步驟Anti-Phospho MST1R (Ser1394) Antibody研究領(lǐng)域 免疫學(xué) 發(fā)育生物學(xué) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

硫酸奎寧保存Anti-Phospho NCF4 (Thr154) Antibody研究領(lǐng)域 神經(jīng)生物學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 表觀遺傳學(xué)

檸檬酸〖鋅〗實(shí)驗(yàn)步驟Anti-Phospho MYL12A (S19/S20) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 心血管 細(xì)胞生物 免疫學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 表觀遺傳學(xué)

N-乙酰-D-氨基葡萄糖使用說明書Anti-Phospho NCOA2 (Ser736) Antibody研究領(lǐng)域 細(xì)菌及

蔗糖價(jià)格Anti-Phospho NEK9 (Thr210) Antibody研究領(lǐng)域 細(xì)胞生物 神經(jīng)生物學(xué)

反玉米素使用說明書Anti-Phospho NF2 (Ser518) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 免疫學(xué)

蛋白胨C價(jià)格Anti-Phospho NFAT5 (Ser1197) Antibody研究領(lǐng)域 心血管 細(xì)胞生物 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)胞凋亡 表觀遺傳學(xué)

GAM瓊脂保存Anti-Phospho NIBAN2 (Ser679/683) Antibody研究領(lǐng)域 免疫學(xué) 染色質(zhì)和核信號 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 表觀遺傳學(xué)

柱式 DNA 膠回收試劑盒50 次品牌Anti-Phospho NIFK (Thr234) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 細(xì)胞生物 免疫學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 激酶和磷酸酶

柱式探針純化試劑盒10 次品牌Anti-Phospho ODF2 (S796) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 免疫學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 激酶和磷酸酶

鮭魚精 DNA 溶液1mL說明書Anti-Phospho PFKFB2 (Ser483) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 免疫學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 激酶和磷酸酶

dCTP 溶液，2.5mM2mL品牌Anti-Phospho OXSR1 (Thr185) Antibody研究領(lǐng)域 腫瘤 細(xì)胞生物 免疫學(xué) 染色質(zhì)和核信號 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

革蘭氏染色液Anti-ECM1   番茄紅素

十六烷基*基溴化銨培養(yǎng)基Anti-ED-1   番瀉苷B

乙酰胺培養(yǎng)基Anti-EGF-R   反式茴香腦

綠膿菌素測定培養(yǎng)基PDP基礎(chǔ)Anti-EGFR-ⅤⅢ  茯苓酸

甘油Anti-Egr-1   防己諾林堿

綠膿菌素測定用培養(yǎng)基PDP斜面限供汽運(yùn)Anti-Emp1   佛手柑內(nèi)酯

培養(yǎng)基anti-EMAb  標(biāo)準(zhǔn)品

明膠生化管Anti-Endostatin  扶桑甾

明膠培養(yǎng)基Anti-EpCAM  番瀉苷元A

硝酸鹽蛋白胨培養(yǎng)基Anti-EPEC-IgG O   番瀉苷元B
單純皰疹病毒通用PCR檢測試劑盒價(jià)格組織磷脂酶B（Phospholipase B）活性比色法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷脂酶A2（Phospholipase A2）活性熒光定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷脂酶A2（Phospholipase A2）活性比色法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷酸腺苷脫氨酶（AMPD）活性比色法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（phosphoglucose isomerase；GPI）活性光譜法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase；PGM）活性光譜法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷酸甲戊二羥酸激酶（phosphomevalonate kinase）活性比色法定量elisa試劑盒    20次    *

組織磷酸果糖激酶（PHOSPHOFRUCTOKINASE）酶連續(xù)循環(huán)比色法定量elisa試劑盒    20次    *
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。