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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
DimethylmatairesilN-乙酰-L-脯氨酸 98%2,6-二氯苯肼鹽酸鹽 98%

Drimiopsin CN-乙酰-L-纈氨酸 98%2,6-二氟吡啶-3-酸 95%

Drimiopsin DDL-精氨酸 98%3,4-二氯苯肼鹽酸鹽 97%

EuxanthoneL-精氨酰胺 98%2-氟苯肼鹽酸鹽 97%

gamma-MangostinN-乙酰-L-色氨酸 98%3-氟苯肼鹽酸鹽 97%

Garcinexanthone AN-乙酰-D-蛋氨酸 99%6-氟吡啶-3-酸 96%

Garciniaxanthone EN-CBZ-D-氨酸 96%2-氟吡啶-3-酸 97%

Garcine CDL-氨酸甲酯鹽酸鹽 98%2-羥基-5-氟吡啶 97%

Garcine DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯 98%2-氟-5-羥基吡啶 95%

Garcine EN-乙酰-D-色氨酸 98%3-氟-5-羥基吡啶 97%

GartaninD-氨基 98%3-氟-2-羥基吡啶 97%

GentiseinD-a-氨基己二酸 97%2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸 98%

GriffipavixanthoneD-天門冬氨酸-β-甲酯 BR2-氟-3-羥基吡啶 97%

Iriflophene 3-C-beta-D-glucopyrasideD-氨酸乙酯鹽酸鹽 BR4-氟苯肼鹽酸鹽 97%

IriflopheneL-天門冬氨酸-β-芐酯  98%4-羧基苯肼鹽酸鹽 98%

Isogarciniaxanthone ED-天門冬氨酸-β-芐酯 BR2-肼基苯甲酸鹽酸鹽 98%

對(duì)溴苯氧乙酸(>95%,Ind Grade)eIF3C AntibodyPhospho-Lyn (Tyr396)  磷酸化膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體

對(duì)基苯甲酸(>98%,BR)DLK1 Antibodyphospho-LSP1 (Ser252)  磷酸化白細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白抗體

對(duì)乙氧基苯甲(>98%,BR)ENPP1 Antibody (Human Specific)phospho-LSP1 (Ser204)  磷酸化白細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白抗體

4-羥基(>98%,BR)Met (D1C2) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)Phospho-LRP6(Thr1479)  磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抗體

4-苯甲酸(>98%,BR)Mili AntibodyPhospho-LRP6 (Ser1490)  磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抗體

對(duì)甲苯(>98.5%,BR)MATK/CHK (D2I6U) Rabbit mAbphospho-LRP5(Thr1492)  磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5抗體

對(duì)甲氧基苯乙酮(>98%,BR)Histone Deacetylase 4 (HDAC4) Antibodyphospho-LRP1(Ser4523)  磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1抗體

4-甲氧基酚(>98%,BR)Naked2 (C67C4) Rabbit mAbphospho-LLGL1 + LLGL2(Ser650+Ser654)  磷酸化相似腫瘤抑制基因HUGL抗體

對(duì)甲基肉桂酸(>98%,BR)Naked2 (C67C4) Rabbit mAbPhospho-LKB1(Thr189)  磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抗體

4-甲基傘形酯-N-乙酰-b-D-氨基半乳糖苷(>98%,BR)Axin1 (C95H11) Rabbit mAbphospho-LKB1(Ser428)  磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抗體
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