注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Chlorobutal4-氟苯硫酚 98%桂酸異酯 ≥96%, FG

2-Ethyl-1-butal4-氟苯基乙硫 96%可可 ≥95%，Kosher

Cinnamyl alcohol2-氟茴香硫 98%可可 95%

1-nal4-氟硫代苯甲 97%丁香酚甲 98%

2-nall2-氟硫代苯甲酰胺 98%異丁香酚甲 99%

1-Octadecal4-氟苯基異硫酸酯 98%異丁香酚甲 ≥98%,FCC

1-Hexadecal4－氟苯硫脲 99%2-甲基庚酸  98%

1-Pentadecal4-(4-氟苯甲?；?丁酸 98%乙酸薄荷酯  98%

Tetradecal糠基硫 98%5-甲基-2-苯基-2-己烯 95%

Cyclohexal4-羥基硫代苯甲酰胺 98%5-甲基-2-苯基-2-己烯 ≥95%, Kosher, FG

2,5-Dimethylcyclohexal4-羥基-3-乙酮 98%3-甲硫基 98%

3,5-Dimethyl-3-hexal3-吡啶 98%3-甲基戊酸 99%

3-Methylcyclohexal對異基苯酚 98%3-甲基戊酸 ≥98%, FG

Farnesol4-異基苯硫酚 96%乙酸薄荷酯  ≥98%, FCC

1-Heptal2-異基苯硫酚 90%2-甲基-4-戊烯酸 98%

n-Octal2--5-甲基噻吩 97%2-甲基-4-戊烯酸 ≥98%，F(xiàn)CC

多氯聯(lián)苯 (Aroclor 1254)標樣(100μg/mL,基體:甲)TNF-R2 AntibodyLIMS1  整合素和生長因子樣蛋白1抗體

甲基毒死蜱標準溶液(10μg/ml,u=6～4%,酮)TNF-R2 AntibodyLIMK1  單絲氨酸蛋白激酶1抗體

解毒喹(標準品)Sox2 (C70B1) Rabbit mAb (IHC Preferred)LILRB3/CD85a/PirB  白細胞免疫球蛋白樣受體-B抗體

綠麥隆標準溶液(100μg/ml,u=4%)OSR1 AntibodyLigamentum Nuchae Elastin  項韌帶彈性蛋白抗體

氯丹溶液(基體：異辛烷)Caspr2 AntibodyLIFR/CD118  白血病抑制因子受體抗體

敵草隆(99%)GP130 AntibodyLIF  白血病抑制因子抗體

二溴磷(標準品)Phospho-MLKL (Ser345) (D6E3G) Rabbit mAbLI-cadherin  肝腸鈣粘連蛋白抗體

氟氯菊酯標準溶液(10μg/ml,u=5%,基體：正己烷)NPRL2 (D8K3X) Rabbit mAbLHX6  轉(zhuǎn)錄因子LHX6抗體

四螨(分析標準品,98.6%)NF-κB2 p100/p52 (D7A9K) Rabbit mAbLHX2  調(diào)控胚胎干細胞分化蛋白Lhx2抗體

四聚乙(97%)MCM7 (D10A11) XP® Rabbit mAbLHRH/GNRH  黃體激素釋放激素類似物抗體
產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR檢測試劑盒廠家環(huán)化核苷酸調(diào)控陽離子通道蛋白亞型2/4抗體Triptobenzene H中文名：別名：Hypoglic acid分子式：C21H28O4

神經(jīng)保護肽HN抗體Paniculoside III中文名：別名：分子式：C26H38O9

類白細胞抗原B272-Acetoxy-3-deacetoxycaesaldekarin E中文名：別名：分子式：C24H30O6

肌側索硬化癥相關蛋白HECW1抗體Methyl 7β,15-dihydroxydehydroabietate中文名：別名：分子式：C21H30O4

3-羥氨苯甲酸雙加氧酶抗體Taxagifine中文名：別名：分子式：C37H44O13
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。