注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
化銣(分子生物學(xué)級(jí))Vitamin D3 Receptor (D2K6W) Rabbit mAb2-基酰基

多聚賴氨酸mGluR1 (D5H10) Rabbit mAb2,2,2-三氟酰

司班80;司盤80c-Raf (D5X6R) Mouse mAb2-溴-5-氟溴芐

聚二1000RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb2,6-二甲

胰蛋白胨(BD)SimpleChIP® Human PMAIP1 Intron 1 Primers氨基-2,5-二氟甲

丹磺酰MRP2/ABCC2 (D9F9E) Rabbit mAb溴-2,5-二氟

N-基順二酰亞Phospho-Chk2 (Thr68) Blocking Peptide1,二氮雜環(huán)庚烷-1-甲酸叔丁酯

碳酸氫(AR)EphB6 Antibody2-甲基-戊氧基酸

十二烷基磺酸鈉(BR)Rab7 (D95F2) XP® Rabbit mAb (HRP Conjuga)2--基吡啶

茶Exportin 5 (D7W6W) Rabbit mAb5-溴-2-氟酚

纖維素酶Phospho-Vimentin (Ser83) (D5A2D) Rabbit mAb氟

硫酸軟骨素Phospho-p53 (Ser15) (D4S1H) Rabbit mAb (Rodent Specific)羥基-2-甲基吡啶

異煙酸Phospho-p53 (Ser15) (D4S1H) Rabbit mAb (Rodent Specific)2--氟-5-硝

L-蘋果酸Phospho-p53 (Ser15) (D4S1H) Rabbit mAb (Rodent Specific)2-氨基磺?；?N,N二甲基煙酰

蛋白酶K溶液(20 mg/ml)LIN28A (D1A1A) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)N,N-二甲基甘氨酸

多聚賴氨酸0.1%溶液DAG Lipase β (D4P7C) Rabbit mAb2-溴-氟

鹽酸四環(huán)素溶液,50 mg/mlE-Ras (D5G5J) Rabbit mAb2--5-基嘧啶

8-羥基喹啉硫酸鹽(植物細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))Cleaved Histone H3 (Thr22) (D7J2K) Rabbit mAb2-硝基-甲砜基甲酸

豚鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原(KL-6)ELISA試劑盒sFRP-4  內(nèi)膜100 ul

豚鼠25羥基維生素D3(25 HVD3)ELISA試劑盒Endostatin  內(nèi)皮抑素/內(nèi)皮他丁100 ul

山羊ELISA試劑盒Endo G  核酸內(nèi)切酶G100 ul

山羊甲狀旁腺激素(PTH)ELISA試劑盒beta endorphin  β-內(nèi)啡肽100 ul

山羊黃體生成素(LH)ELISA試劑盒envelope glycoproin (Yellow fever virus)  黃熱病毒包膜糖蛋白100 ul

山羊氧化酶(XOD)ELISA試劑盒ENPP1/PC-1  核苷酸內(nèi)焦酸酶/酸二酯酶1100 ul

山羊還原型谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒ENPP3/CD203c  ENPP3IgG100 ul

山羊*酶(CAT)ELISA試劑盒EpCAM/CD326  上皮細(xì)胞粘附分子100 ul

山羊骨形成蛋白2(BMP-2)ELISA試劑盒E.coli O6  大腸桿菌埃希桿菌O6（腸致病性大腸桿菌O6）100 ul
梅毒螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒廠家整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶樣3蛋白抗體Neorauflavene中文名：別名：分子式：C21H20O5

去整合素樣金屬蛋白酶20抗體Sanggen N中文名：別名：分子式：C25H26O6

去整合素樣金屬蛋白酶23抗體Dodonaflavol中文名：別名：分子式：C28H32O9

去整合素樣金屬蛋白酶28抗體Glepidotin B中文名：別名：分子式：C20H20O5

去整合素樣金屬蛋白酶32抗體3,6-Dimethoxyapigenin中文名：3,6-二甲氧基芹菜素別名：分子式：C17H14O7
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。