注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
2-溴酚(標(biāo)準(zhǔn)品)Axin1 (C95H11) Rabbit mAb反-N,N′-二甲基環(huán)己烷-1,2-二

鄰二甲酸丁芐酯(標(biāo)準(zhǔn)品)Mena Antibody辛

鄰二甲酸丁芐酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑：甲)eIF5A (D8L8Q) Rabbit mAb溴-5-甲基-2-甲氧基基酸

聯(lián)菊酯(標(biāo)準(zhǔn)品)Syk (4D10) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)2-METHOXY-6-METHYLBIPHENYL-CARBOXYLIC ACID

聯(lián)菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=3%,基體：石油)TMP21 Antibody甲氧基水楊酸甲酯

芐嘧磺隆(標(biāo)準(zhǔn)品)DR3 (D4O3X) Rabbit mAb1,1'-雙(羥基基)環(huán)己烷;雙酚Z

草除靈(標(biāo)準(zhǔn)品)NO66 (D7C8E) Rabbit mAb異硫酸酯

仲丁(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IKKα (Ser176)/IKKβ (Ser177) (C84E11) Rabbit mAbN-丁基-溴-磺酰

聯(lián)(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IKKα (Ser176)/IKKβ (Ser177) (C84E11) Rabbit mAb順-1,2-二

聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0ug/ml,基體：甲)Miwi (G82) Antibody1-并噻酚-2-羧

正丁酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Cyclin E1 (D7T3U) Rabbit mAb(3R)-(+)-(氨基)吡咯烷

溴聯(lián)(標(biāo)準(zhǔn)品)CHIP (C3B6) Rabbit mAb吡啶-N-氧化物

對(duì)叔丁基酚(PTBP)(標(biāo)準(zhǔn)品)La Antigen AntibodyBROMO-5-CHLORO-2-MORPHOLINOPYRIDINE

3,并芘(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Raptor (Ser792) AntibodyN-基二

1,丁二(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Raptor (Ser792) Antibody酸二丁酯

2-溴(標(biāo)準(zhǔn)品)EGF Receptor (E746-A750del Specific) (D6B6) XP® Rabbit mAb(METHYLBUTANOYL)PHENYLBORONIC ACID

2-溴(標(biāo)準(zhǔn)品)Axin1 (C76H11) Rabbit mAbN-(METHOXYBENZYL)-N-METHYLBENZENESULFONAMIDE

正丁(農(nóng)殘級(jí))Axin1 (C76H11) Rabbit mAb匹立尼酸

γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒Delta Opioid Receptor  D型阿片受體100 ul

γ分泌素激活蛋白(PION)ELISA試劑盒Phospho-delta Opioid Receptor (Ser363)  酸化D型阿片受體100 ul

γ分泌酶ELISA試劑盒KLK3  激肽釋放酶3/舒血管素3100 ul

γ氨基丁酸(GABA)ELISA試劑盒KLK4  激肽釋放酶4100 ul

β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白(BTRC)ELISA試劑盒KLK7  激肽釋放酶7100 ul

β抑制蛋白2(ARRB2)ELISA試劑盒KLK9  激肽釋放酶9100 ug

β血小板球蛋白/β血栓環(huán)蛋白(β-TG)ELISA試劑盒KLK10  激肽釋放酶10100 ul

β細(xì)胞素(BTC)ELISA試劑盒KLK14  激肽釋放酶14100 ul

β位淀粉樣前體蛋白裂解酶2(BACE2)ELISA試劑盒KMT6/EZH2  抑癌蛋白EZH2100 ul
沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)CD86抗體Methyl gallate中文名：沒(méi)食子酸甲酯別名：分子式：C8H8O5

周期素依賴性激酶1抗體Puerol A中文名：別名：分子式：C17H14O5

周期素依賴性激酶2抗體1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)heptane-3,5-diyl diacetate中文名：別名：分子式：C23H28O7

周期素依賴性激酶5抗體Orsellinic acid中文名：苔色酸別名：分子式：C8H8O4

周期素依賴性激酶4抗體Acetovanillone中文名：香草乙酮?jiǎng)e名：分子式：C9H10O3
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。